Acta Univ. Agric. Silvic. Mendelianae Brun. 2009, 57(5), 313-318 | DOI: 10.11118/actaun200957050313
Optimalizace kvalitativní a semikvantitivní detekce geneticky modifikovaných plodin pomocí PCR
- Ústav biologie rostlin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika
Pro kvalitativní a semikvantitivní detekci geneticky modifikované kukuřice byly použity dva genotypy kukuřice firmy Monsanto. Jednalo se o transgenní hybrid Bt-kukuřice na bázi MON810 a geneticky nemodifikovanou kontrolu (izogenní linie k Bt-kukuřici). Získané osivo bylo předmětem "material transfer agreement" mezi Monsanto Europe, s.a. a MZLU v Brně. Pro molekulární analýzy byla genomová DNA izolována pomocí izolačního kitu DNeasy Plant Mini Kit z napěstovaných semenáčů při teplotě 20 °C a světelném režimu 12 hodin světlo a 12 hodin tma, ve fázi jednoho listu (deset dní staré rostliny). Napěstování a izolace genomové DNA probíhala v prostorách určených pro práci s GMO. Koncentrace DNA ve vzorku byla po izolaci zjištěna fluorimetricky. V práci byly použity primery a PCR programy publikované v pracech Greiner et al. (2005) a Hernandéz et al. (2005). Prvním krokem pro zavedení PCR metod detekce Bt-kukuřice byla optimalizace protokolu pro detekci kukuřičného genomu a detekci specifické oblasti geneticky modifikované kukuřice MON810. Pro detekci genomu kukuřice byly vybrány primery IVR1-F a IVR1-R (invertase gene), které verifikují přítomnost kukuřičného genomu produktem o velikosti 226 bp. Pro kvalitativní detekci insertu v Bt-kukuřice MON810 byly vybrány dvě primerové kombinace pro detekci 35S CaMV promotoru (primery VW01/VW03 a BT03/BT04), kdy přítomnost verifikuje produkt o velikost 178 bp, resp. 280 bp. Při použití primerů BT03/BT04 a příslušného PCR programu byl získán slabý pozitivní ohlas jen v jednom případě. Na základě výsledků kvalitativní PCR, kdy byla v případě použití primerů VW01/VW03 100% úspěšná amplifikace, byly tyto vybrány pro optimalizaci při semikvantitativní PCR. Podle dosažených výsledků lze doporučit odběr amplifikačního produktu ve 30. cyklu PCR reakce. Na výsledném elektroforetogramu řady směsných vzorků s různým podílem genomu geneticky modifikované kukuřice bylo možné vidět zvyšující se množství amplifikovaného produktu v závislosti na množství DNA Bt-kukuřice ve vzorku a v závislosti na počtu reakčních cyklů. Ve vytvořené řadě směsných vzorků s různým podílem genomu geneticky modifikované kukuřice v analyzovaném vzorku byl stanoven detekční limit 1 %. V závěrečném experimetu bylo přistoupeno k otestování multiplex PCR s primery a PCR programem, které uvádějí Greiner et al. (2005). Pro multiplex PCR byl použit stejný objem reakční směsi PCR reakce jako v případě standardní PCR s tím rozdílem, že byla koncentrace každého primeru snížena z 7,5 μM na 3,75 μM. Tento protokol je však vhodné ještě dále optimalizovat. V našem případě v elektroforetogramu dominovaly produkty velikosti 226 bp (invertase gene) nad produkty 178 bp detekující přítomnost 35S promotoru CaMV v genomu Bt-kukuřice. Prezentované výsledky ukazují optimalizaci PCR metod pro kvalitativní a semikvantitativní detekci DNA geneticky modifikované Bt-kukuřice MON810. Tyto metody je vhodné využít pro vlastní kvalitativní detekci a případně pro screeningové analýzy GMO v potravinách nebo vzorcích osiva.
PCR, kvalitativní detekce, semikvantitativní detekce, multiplex PCR, transgenní kukuřice, MON810
Optimisation of qualitative and semi-quantitative detection of genetically modified crops by PCR
For qualitative and semi-quantitative detection of genetically modified crops we selected the detection of the frequently used promoter 35S CaMV. To optimise the method we used two commercially available genotypes of maize from the company Monsanto (USA), i.e. the transgenic hybrid Bt-maize line MON810 and a genetically non-modified control (isogenic line to MON810). We tested the primers and PCR programmes described by Greiner et al. (2005) and Hernandéz et al. (2005). When applying PCR methods of detection of Bt-maize the first step was to optimise the protocol for the detection of the maize genome and detection of the specific sites of genetically modified MON810 maize. For detection of the maize genome we selected the primers IVR1-F and IVR1-R (invertase gene) which verify the presence of the maize genome by a 226 bp product. For qualitative detection of the insert of Bt-maize MON810 the primer pairs VW01/VW03 (Greiner et al., 2005) and BT03/BT04 (Hernandéz et al., 2005) were used to detect the 35S CaMV promoter. Products of the size 178 bp and 280 bp, respectively, verify its presence. Based on the results of qualitative PCR we selected the primers VW01/VW03 for semi-quantitative detection of the amount of DNA of Bt-maize. For semi-quantitative PCR we have chosen sampling of the amplification product in the 30th cycle of the PCR reaction. In the genetically unmodified control a detection limit of 1% of admixture of Bt-maize was determined when using semi-quantitative PCR. The same primers as for semi-quantitative PCR were also used for multiplex PCR but with half the concentration of primers for standard PCR. This protocol however will have to be further optimised. The presented results introduce PCR methods for qualitative and semi-quantitative detection of DNA of the genetically modified Bt-maize MON810 which can also be used for other GM crops containing the 35S CaMV promoter. It could be suitable to use these methods for the qualitative detection and/or for screening analyses of the detection of successfulness of transformation experiments.
Keywords: PCR, qualitative detection, semi-quantitative detection, multiplex PCR, transgenic crops, maize MON810
Grants and funding:
The study was funded by projects of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic 1M06030 and 1686/F4a/2008.
Received: May 6, 2009; Published: October 10, 2014 Show citation
| ACS | AIP | APA | ASA | Harvard | Chicago | IEEE | ISO690 | MLA | NLM | Turabian | Vancouver |
References
- DI PINTO, A., ALFANO, F., GIORSANO, A., CAPUANO, F., VALENTINA, T. and TANTILLO, G., 2008: Quantitative real-time polymerase chain reaction for the presence of genetically-modified maize in breaded "ready-to-cook" food products. Food Control, 19: 1002-1005. ISSN 0956-7135. DOI: 10.1016/j.foodcont.2007.10.008
Go to original source... - Greiner, R., Konietzny, U. and Villavicencio, A. L. C. H., 2005: Qualitative and quantitative detection of genetically modified maize and soy in processed foods sold commercially in Brazil by PCR-based methods. Food Control, 16: 753-759. ISSN 0956-7135. DOI: 10.1016/j.foodcont.2004.06.015 Go to original source...
- Hernández, M., Pla, M., Esteve, T., Prat, S., Puigdomenech, P. and Farrado, A., 2003: A specific real-time quantitative PCR detection system for event MON810 in maize YieldGard® based on the 3'-transgene integration sequence. Transgenic Research, 12: 179-189. ISSN 0962-8819. DOI: 10.1023/A:1022979624333 Go to original source...
- HERNANDÉZ, M., RODRÍGUEZ-LÁZARO, D., ZHANG, D., ESTEVE, T., PLA, M. and PRAT, S., 2005: Interlaboratory transfer of a PCR multiplex method for simultaneous detection of four genetically modified maize lines: Bt11, MON810, T25 and GA21. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 3333-3337. ISSN 0021-8561. DOI: 10.1021/jf049192y Go to original source...
- Holck, A., Va, M., Didierjaen, L. and Rudi, K., 2002: 5'-Nuclease PCR for quantitative event-specific detection of the genetically modified Mon810 MaisGard maize. European Food Research Technology, 214: 449-453. ISSN 1438-2377. DOI: 10.1007/s00217-001-0473-y Go to original source...
- Ma, B. L., Subedi, K., Evenson, L. and Stewart, G., 2005: Evaluation of detection methods for genetically modified traits in genotypes resistant to European corn borer and herbicides. Journal of Environmental Science and Health, 40: 663-644. ISSN 0360-1234. DOI: 10.1081/PFC-200061573 Go to original source...
- MARKOULATOS, P., SIAFAKAS, N. and MONCANY, M. J., 2002: Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 16: 47-51. ISSN 0887-8013. DOI: 10.1002/jcla.2058 Go to original source...
- Yang, L., Xu, S., Pan, A., Yin, Ch., Zhang, K., Wang, Z., Zhou, Z. and Zhang, C., 2005: Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5'-transgene integration sequence. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 9312-9318. ISSN 0021-8561. DOI: 10.1021/jf051782o Go to original source...
- VAN RIE, J., JANSENS, S., HӦFTE, H., DEGHEELE, D. and VAN MELLAERT, H., 1998: Specificity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin. Importance of specific receptors on the brush border membrane of the mid-gut of target insects. European Journal of Biochemistry, 186: 239-247. ISSN 0014-2956. Go to original source...
- Vaughn, T., Cavato, T., Brar, G., Coombe, T., Degooyer, T., Ford, D. S., Groth, M., Howe, A., Johnson, S., Kolacz, K., Pilcher, C., Purcell, J., Romano, C., English, I. and Pershing, A. J., 2005: Method of controlling corn rootworm feeding using a Bacillus thuringiensis protein expressed in transgenic maize. Crop Science, 45: 931-938. ISSN 1435-0653. DOI: 10.2135/cropsci2004.0304 Go to original source...
This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License (CC BY NC ND 4.0), which permits non-comercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original publication is properly cited. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.