Acta Univ. Agric. Silvic. Mendelianae Brun. 2009, 57(5), 49-56 | DOI: 10.11118/actaun200957050049
Studium enterokoků a jejich role v produkci tyraminu během výroby a zrání polotvrdých sýrů
- Ústav technologie potravin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika
Enterokoky se vyskytují jako přirozená součást zažívacího traktu většiny savců a ptáků (FRANZ et al., 1999). Výskyt enterokoků v mléku a sýrech bývá často spojován s nedostatečnou hygienickou kvalitou výroby. Jako kontaminanty se do těchto potravin dostávají převážně vlivem nedostačujících hygienických podmínek v průběhu výroby sýrů a mohou působit negativně na tvorbu aromatických složek. Zdrojem jsou nejčastěji kravské fekálie, kontaminovaná voda, vybavení mlékárenského podniku nebo tanky pro skladování mléka (GELSOMINO et al., 2001). Některé kmeny přežívají pasterační teploty, proto jsou běžnou součástí mikroflóry pasterovaného mléka (LITOPOLOU-TZANETAKI et al., 1992). Enterokoky hrají důležitou roli při tvorbě biogenních aminů ve fermentovaných potravinách (KOMPRDA et al., 2007; BURDYCHOVA and KOMPRDA 2007). Cílem této práce bylo sledování vlivu enterokoků na produkci biogenního aminu tyraminu během zrání eidamských sýrů. Analyzovány byly vzorky sýrů pocházející od dvou výrobců (výrobce I a II). Analýzy byly provedeny v den výroby a 30, 90 a 180 dní po výrobě.
Ze sýrů byly izolovány bakterie rodu Enterococcus, které byly dále identifikovány a charakterizovány pomocí rodově a druhově specifických PCR. Identifikované izoláty byly prověřeny na schopnost tvořit biogenní amin tyramin pomocí PCR popsané COTONEM a kol. (2004) a pomocí HPLC popsané BURDYCHOVOU a DOHNALEM (2007). Cílem práce bylo dále určit souvislost mezi počtem enterokoků a množstvím tyraminu v sýrech.
Během šesti měsíců zrání polotvrdých sýrů bylo izolováno celkem 361 presumptivních enterokoků, 285 izolátů bylo pomocí rodově specifické PCR zařazeno k rodu Enterococcus. Druhová identifikace izolátů byla provedena pomocí druhově specifických PCR. Ze 165 izolátů, které pocházely ze vzorků sýrů výrobce I, bylo 81 zařazeno ke druhu E. faecium, 39 ke druhu E. durans, 21 ke druhu E. faecalis, 19 ke druhu E. casseliflavus a tři ke druhu E. hirae. Dva izoláty nebyly použitými metodami identifikovány. Izoláty pocházející ze vzorků sýrů výrobce II byly identifikovány takto: 52 izolátů bylo zařazeno ke druhu E. faecium, 38 ke druhu E. faecalis, 14 ke druhu E. durans, 12 ke druhu E. casseliflavus, tři ke druhu E. hirae; jeden izolát nebyl použitými metodami identifikován.
Sekvence kódující tyrosindekarboxylázu byla detekována u deseti enterokoků izolovaných ze sýrů výrobce I a pěti enterokoků izolovaných ze sýrů výrobce II. Produkce biogenního aminu tyraminu byla prokázána u všech těchto izolátů. Izoláty byly identifikovány jako zástupci druhů E. faecium, E. faecalis a E. durans. Bylo prokázáno, že existuje souvislost mezi počty těchto druhů a tvorbou tyraminu při zrání polotvrdých sýrů.
Z výsledků této práce vyplývá, že v sýrech s vyšším počtem enterokoků s prokázanou schopností tvořit tyramin byl stanoven vyšší obsah tyraminu. Očekávaná vyšší koncentrace tyraminu v sýrech výrobce I (v porovnání se sýry výrobce II) byla potvrzena porovnáním obsahu tyraminu v jednotlivých sýrech. Množství tyraminu v sýrech výrobce I bylo přibližně čtyřikrát vyšší (70 mg/kg) než v sýrech výrobce II. Množství tyraminu v sýrech výrobce I dokonce po 120 dnech zrání přesáhlo toxikologický limit (100 mg/kg).
Výskyt a role enterokoků v polotvrdých sýrech byla již dříve diskutována BURDYCHOVOU a KOMPRDOU (2007). Pro redukci počtu enterokoků a redukci koncentrace tyraminu v polotvrdých sýrech je doporučováno striktní dodržení správných hygienických podmínek během výroby sýrů. Obecně lze říci, že je dlouhá perioda zrání sýrů podporuje tvorbu biogenních aminů. Z tohoto důvodu nejsou dlouhozrající sýry doporučovány pro pravidelnou konzumaci ve větších množstvích, zejména ne osobám často trpícím bolestmi hlavy a migrénami.
polotvrdé sýry, Enterococcus, rodově a druhově specifická PCR, gen pro tyrosindekarboxylázu, tyramin
Study of enterococci during cheese manufacture and ripening and evaluation of their role in tyramine production
The aim of this study was isolation, identification and characterization of bacteria of the genus Enterococcus from Duch-type semi-hard cheese during manufacture and ripening. Cheese samples from two different producers (I and II) were used at the production day and after 30, 90 and 176 days of ripening.
Altogether 361 suspected enterococci isolates were obtained from cheese samples during 7 month of ripening. Using genus-specific PCR, 285 isolates were identified as the members of the genus Enterococcus. The identification of five Enterococcus species was performed by PCR using species-specific primers. Among 165 Enterococcus spp. isolates of producer I, 81 isolates were classified as E. faecium, 39 as E. durans, 21 as E. faecalis, 19 as E. casseliflavus and 3 as E. hirae, and 2 isolates were not classified into species. Enterococci species among isolates of producer II were as follows: 52 isolates of E. faecium, 38 of E. faecalis, 14 of E. durans, 12 of E. casseliflavus, 3 of E. hirae and 1 was not classified into species. E. faecium was found to be the dominating species in all cheese samples. The gene coding for tyrosine decarboxylase was detected in 10 enterococci isolates of producer I and in 5 enterococci isolates of producer II. Production of biogenic amine tyramine was confirmed in all these isolates, which were of E. faecium, E. faecalis and E. durans species. It was confirmed that these species are important for tyramine production. There is the relationship between tyramine production and counts of E. faecium, E. faecalis and E. durans. No tyramine production was observed in isolates of E. casseliflavus or E. hirae species.
Keywords: semi-hard cheese, Enterococcus, genus and species-specific PCR, tyrosine decarboxylase gene, tyramine
Grants and funding:
This work was partially supported by grant no. 2102/IG260271 from Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno.
Received: June 12, 2009; Published: October 10, 2014 Show citation
ACS | AIP | APA | ASA | Harvard | Chicago | IEEE | ISO690 | MLA | NLM | Turabian | Vancouver |
References
- Arizcun, C., Barcina, Y., Torre, P., 1997: Identification and characterization of proteolytic activity of Enterococcus ssp. isolated from milk and Runcal and Idiazabal cheese. Int. J. Food Microbiol., 38: 17-24. DOI: 10.1016/S0168-1605(97)00091-3
Go to original source...
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., 1994: Current protocols in molecular biology. New York, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience.
- Bottger, E. C., 1989: Rapid determination of bacterial ribosomal RNA sequences by direkt sequencing of enzymatically amplified DNA. FEMS Microbiol Lett., 65: 171-176. DOI: 10.1111/j.1574-6968.1989.tb03617.x
Go to original source...
- Bover-Cid, S., Holzapfel, W. H., 1999: Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology., 53: 33-41. DOI: 10.1016/S0168-1605(99)00152-X
Go to original source...
- Burdychova, R., Dohnal, V., 2007: The use of HPLC method for determination of microbial tyrosine decarboxylase expression product. Chemické listy, 101: 907-910.
- Burdychova, R., Komprda, T., 2007: Biogenic amine forming microbial communities in cheese. FEMS Microbiol Lett., 276, 149-155. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2007.00922.x
Go to original source...
- Cogan, T. M., Barbosa, M., Beuvier, E., Bianchi-Salvadoris, B., Cocconcelli, P. S. Fernandes, I., Gomez, J., Gomez, R., Kalantzopoulos, G., Ledda, A., Medina, M., Rea, M. C., Rodriguez, E., 1997: Characterization of the lactic acid bacteria in artisanal dairy products. J. Dairy Res., 64: 409-421. DOI: 10.1017/S0022029997002185
Go to original source...
- Coton, M., Coton, E., Lucas, P., Lonvaud, A., 2004: Identification of the gene encoding a putative tyroxine decarboxylase of Carnobacterium divergens 508. Development of molecular tools for the detection of tyramine-producing bacteria. Food Microbiol., 21: 125-130. DOI: 10.1016/j.fm.2003.10.004
Go to original source...
- Deasy,, B. M., Rea, M. C., Fitzgerald, G. F., Cogan, T. M., Beresford, T. P., 2000: A rapid PCR based method to distinguish between Lactococcus and Enterococcus. System. Appl. Microbiol., 23: 510-522. DOI: 10.1016/S0723-2020(00)80025-9
Go to original source...
- Devriese, L. A., Laurier, L., De Herdt, P., Haesebrouck, F., 1992: Enterococcal and streptococcal species isolated from faeces of calves, young cattle and dairy cows. J. Appl. Bacteriol., 72: 29-31.
Go to original source...
- Devriese, L. A., Pot, B., van Damme, L., Kersters, K., Haesebrouck, F., 1995: Identification of Enterococcus species isolated from foods of animal origin. Int. J. Food Microbiol., 26: 187-197. DOI: 10.1016/0168-1605(94)00119-Q
Go to original source...
- Dutka-Malen, S., Avers, S., Courvalin, P., 1995: Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant Enterococci by PCR. J. Clin. Microbiol., 1: 24-27.
Go to original source...
- Facklam, R. R., Collins, M. D., 1989: Identification of Enterococcus species isolated from human infections by a conventional test scheme. J. Clin. Microbiol., 27: 3340-3343.
Go to original source...
- Franz, C. M., Holzapfel, W. H., Stiles, M. E., 1999: Enterococci at the crossroads of food safety. Int. J. Food Microbiol., 47: 1-24. DOI: 10.1016/S0168-1605(99)00007-0
Go to original source...
- Gelsomino, R., Vancanneyt, M., Condon, S., Swings, J., Cogan, T. M., 2001: Enterococcal diversity in the environment of an Irish Cheddar-type cheesemaking factory. Int. J. Food Microbiol., 71: 177-188. DOI: 10.1016/S0168-1605(01)00620-1
Go to original source...
- Gelsomino, R., Vancanneyt, M., Cogan, t. m., Condon, S., Swings, J., 2002: Source of enterococci in a farmhouse raw-milk cheese. Applied and environmental Microbiology, 68: 3560-3565. DOI: 10.1128/AEM.68.7.3560-3565.2002
Go to original source...
- Jackson, Ch. R., Fedorka-Cray, P. J., Barrett, J. B., 2004: Use of a Genus- and Species-Specific Multiplex PCR for Identification of Enterococci. J. Clin. Microbiol., 42 (8): 3558-3565. DOI: 10.1128/JCM.42.8.3558-3565.2004
Go to original source...
- Knijff, E., Dellaglio, F., Lombardi, A., Andrighetto, C., Torriani, S., 2001: Rapid identification of Enterococcus hirae by PCR with primers targeted to the ddl genes. J. Microbiol. Methods., 47: 35-40. DOI: 10.1016/S0167-7012(01)00297-4
Go to original source...
- Komprda, T., Novická, K., Kalhotka, L., Smělá, D., 2005: Biogenic amine content in sterilised and pasteurised long-term stored processed cheese. Czech Journal of Food Sciences. 23 (5): 209-216. DOI: 10.17221/3393-CJFS
Go to original source...
- Komprda, T., Burdychova, R., Dohnal, V., Cwikova, O., Sladkova, P., 2008: Some factors influencing biogenic amines and polyamines content in Dutch-type semi-hard cheese. Eur Food Res Technol, 227:29-36. DOI: 10.1007/s00217-007-0688-7
Go to original source...
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahl, D. A., Sogin, M. L., Pace, N. R., 1989: Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 6955-6956. DOI: 10.1073/pnas.82.20.6955
Go to original source...
- Ledda, A., Sfingu, M. F., Parisi, A., Sanna, S., Mannu, L., 1994: Technologial characterization of lactococci and enterococci for the manufacture of Fiore Sardo scheep cheese. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia., 45: 443-456.
- Litopoulou-Tzanetaki, E., Tzanetakis, N., 1992: Microbiology of white brined cheese made from raw goat milk. Food microbiol., 9: 13-19. DOI: 10.1016/0740-0020(92)80057-B
Go to original source...
- McAuley, C., Gobius, k., Britz, M., Craven, H., 2005: Heat resistance of Enterococcus durans and E. hirae isolated from pasteurised milk. 2nd International ASM-FEMS conference on Enterococci. Helsingor, Denmark.
- Noskin, G. A., 1997: Vancomycin-resistant enterococci: clinical, microbiologic and epidemiologic features. J. Lab. Clin. Med., 130: 14-20. DOI: 10.1016/S0022-2143(97)90054-8
Go to original source...
- Moreno, M. R. F., Leisner, J. J., Tee, L. K., Radu, S., Rusul, G., Vancanneyt, M., De Vuyst, L., 2002: Microbial analysis of Malaysian tempeh and characterization of two bacteriocinss produced by isolats of Enterococcus faecium. J Appl Microbiol., 92: 147-57. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2002.01509.x
Go to original source...
- Salama, M., Sandine, W., Giovannoni, S., 1991: Development and application of oligonucleotide probes for identification of Lactococcus lactis supsp. cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1313-1318.
Go to original source...
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., 1989: Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.
- Stratton, J. E., Hutkins, R. V., Taylor, S. L., 1991: Biogenic amines in cheese and other fermented foods. A review. J. Food Prot., 54: 460-470. DOI: 10.4315/0362-028X-54.6.460
Go to original source...
- Suzzi, G., Caruso, M., Gardini, F., Lombardi, A., Vannini, L., Guerzoni, M. E., Andrighetto, C., Lanorte, M. T., 2000: A survey of the enterococci isolated from an artisanal Italian goat's cheese (semicotto caprino). J. Appl. Microbiol., 89: 267-274. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2000.01120.x
Go to original source...
- Wessels, D., Jooste, P. J., Mustert, J. F., 1990: Technologically important characteristics of Enterococcus isolates from milk and dairy products. Int. J. Food Microbiol., 10: 349-352. DOI: 10.1016/0168-1605(90)90082-G
Go to original source...
This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License (CC BY NC ND 4.0), which permits non-comercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original publication is properly cited. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.