Acta Univ. Agric. Silvic. Mendelianae Brun. 2008, 56(4), 197-206 | DOI: 10.11118/actaun200856040197

Záchrana cenného genotypu borovice blatky s využitím mikropropagačních technik

Hana Vejsadová¹, Helena Vlašínová², Ladislav Havel²

¹ Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, 252 43 Průhonice, Česká republika

² Ústav biologie rostlin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika

Cílem práce bylo zjistit výživové a růstově regulační podmínky indukce in vitro regenerace ze semen borovice blatky. Vzhledem k tomu, že indukce somatické embryogeneze u rodu Pinus probíhá hlavně ze zadržených embryí, která u zralých semen zanikají, byly pokusy se zralými semeny využity k otestování reakce embryí na vybrané růstové regulátory.
Borovice blatka (Pinus uncinata DC. subsp. uliginosa (Neumann) Businský) je subendemitem České republiky, jehož převážná část populací je soustředěna na území České republiky (západní Čechy, Šumava v údolí Křemelné a Vltavy, Třeboňská pánev a po jedné lokalitě ve Žďárských vrších a Hrubém Jeseníku). Všechny zahraniční lokality tohoto taxonu s výskytem fenotypově čistých nehybridních jedinců (celkem méně než deset) jsou buď okrajové části českých populací nebo nepočetné zbytkové populace. Borovice blatka je z řady hledisek velmi vhodným modelovým druhem pro využití moderních výzkumných metod, směřujících k dlouhodobému zachování tohoto taxonu, který se s přibývajícím poznáním jeví jako jedna z nejvíce ohrožených dřevin České republiky. Z hlediska dlouhodobých perspektiv přežití blatky je její pasivní ochrana i v národních přírodních rezervacích nedostačující.
Velkým přínosem vypracované technologie množení borovice blatky je získání dostatečného množství geneticky čistých klonů, které mohou být dlouhodobě uchovány v in- a ex vitro podmínkách. Výsledky regenerace procesem somatické embryogeneze u rodu Pinus naznačují, že i když úspěšnost této metody je závislá na genotypu a na klimatických podmínkách v době zrání semen, je možno cestou modifikace kultivačních podmínek získat dostatečné množství klonů.
V pokuse byla použita zralá semena z osiva Arboreta Sofronka v Bolevci. Jako donorové stromy byly použiti jedinci z NPR Žofinka - katastrální území Dvory nad Lužnicí (semena Z, Z1, odběr v roce 2007) a z lokality u Krajkové, okr. Sokolov (semena K, K1, odběr v roce 2005). Část semen byla namočena do destilované vody po dobu 5 dní při teplotě 5 °C, část semen byla stratifikována bez aplikace vody 1-2 týdny při teplotě 5 °C. Po 2-3 týdnech byly odřezány ze semenáčů kotyledony (dělohy) a segmenty hypokotylu. Explantáty byly přeneseny na iniciační média a kultivovány za 16 h fotoperiody, teploty den/noc 23/19 °C a intenzity světla 55 μmol m-2 s-1. Složení iniciačních médií vycházelo z poloviční koncentrace základních solí v MS živném médiu s obsahem vitaminů, benzyladeninu (BA) v koncentraci 1,5-2,5 mg . l-1 v kombinaci s kyselinou 1-naftyloctovou (NAA) v koncentraci 0,01-0,5 mg . l-1 nebo 0,5-1 mg . l-1 BA s kyselinou indolyl-3-máselnou (IBA) v koncentraci 0,1-0,5 mg . l-1. Média obsahovala 3% sacharózu, 0,1% aktivní uhlí, 0,75% agar Sigma, pH médií bylo 5,6.
Po 12 týdnech bylo provedeno vyhodnocení. Subkultury byly prováděny ve čtyřtýdenních intervalech. Po čtyřech týdnech byla u kotyledonů pozorována proliferace pupenů, u segmentů hypokotylu se tvořil zelený kalus. Po 12 týdnech bylo zjištěno v přítomnosti 1,5 mg . l-1 BA v kombinaci s 0,5 mg . l-1 NAA průkazně nejvíce explantátů s proliferací pupenů (23-85 % explantátů). Kombinace 0,5 mg . l-1 BA s 0,2 mg . l-1 IBA byla sice u některých variant průkazně nižší, ale stimulovala u kultur tvorbu adventivních pupenů. Byly založeny pokusy se zralými semeny k otestování reakce embryí na vybrané růstové regulátory zaměřené na indukci somatické embryogeneze.
V návaznosti na tyto pokusy byla testována i reakce zralých zygotických embryí vybraných jedinců na růstové regulátory s ohledem na možnost indukce somatické embryogeneze. Po povrchové sterilizaci semen a jejich osmidenním máčení ve sterilní destilované vodě při teplotě 4 °C, byla odstraněna testa a extirpována zygotická embrya. Spolu s oddělenými megagametofyty byla přenesena na indukční médium DCR s různými kombinacemi BA (0,56; 2,25 mg . l-1), 2,4-D (0,55; 2,2 mg . l-1), NAA (0,465; 0,93; 1,86 mg . l-1), eventuelně s triacontanolem (10 μg . l-1) (TRIA). Kromě růstových regulátorů byl odzkoušen efekt ztužující substance (Phytagel (Sigma) a Gelrite (Duchefa) (0.3%)) a efekt sacharózy nebo maltózy (3%). Po třech týdnech kultivace byla sledována morfologická odezva jednotlivých variant média. Na základě srovnání po třech týdnech kultivace byl zjištěn významný efekt BA. Ukázalo, že pokud v médiu není přítomen cytokinin, dochází k výraznému prodlužování děloh. Tato reakce byla modifikována přítomností 3% maltózy, pod jejímž vlivem došlo k prodlužování děloh i na médiu s 1,13 mg . l-1 BA. Prodloužení děloh bylo většinou spojeno se zastavením tvorby kalusu, který se u jiných variant tvořil zejména na hypokotylu a k nekrotizaci hypokotylu, ale i na těchto deformovaných dělohách byl pozorován vznik kalusu, tubulárních buněk a za přítomnosti 0,93 mg . l-1 NAA, dokonce kořínků. Rozpadavý, potenciálně embryogenní kalus vznikal na celé škále kombinací růstových regulátorů (BA, NAA, 2,4-D), ale po přenesení na proliferační médium s nižší koncentrací růstových regulátorů (0,113 mg . l-1 BA a 0,44 mg . l-1 2,4-D) byla pozorována vyvíjející se somatická embrya pouze při použití nižších koncentrací BAP (0,56 nebo 1,13 mg . l-1) v kombinaci s 1,86 mg . l-1 NAA k jejich inicializaci. V obou těchto případech byl v našich experimentech v médiu přítomen triacontanol (10 μg.l-1), o kterém je známo, že stimuluje různé fyziologické procesy. Na rozdíl od předcházejících experimentů, týkajících se indukce organogeneze, kde optimální poměr cytokininu a auxinu byl 3:1 (1,5 mg . l-1 BAP a 0,5 mg . l-1 2,4-D), docházelo na dělohách a apexu zygotických embryí ke tvorbě pupenů při opačném poměru cytokininu a auxinu 1:1-4 (0,56 mg . l-1 BAP a 0,93 a 1,86 mg . l-1 2,4-D. Zde se ale tvořily hlavně adventivní pupeny.

Pinus uncinata DC. subsp. uliginosa (Neumann) Businský, semena, organogeneze, somatická embryogeneze

Received: April 1, 2008; Published: November 8, 2014  Show citation